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白芨[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]為蘭科（Orchidaceae）白芨屬（Bletilla Reichb.f.）多年生宿根草本植物，根呈白色，數個相連，故名白芨，別名白及、連及草、甘根。白芨花大色艷，具有較高的觀賞價值；同時白芨生有肥厚的肉質塊狀假鱗莖，是重要的中藥材之一，具有收斂止血、消腫生肌的功效。隨著白芨的持續開發，市場需求連年增長，價格逐漸上漲，致使野生資源私挖濫采嚴重，導致白芨野生資源瀕臨枯竭，現有的白芨資源受到嚴重破壞，已無法滿足市場需求，因而也被國家列為重點保護野生藥用植物之一。
在自然野生狀態下，成熟的白芨種子呈粉末狀，非常細小，開花授粉15周后的種子有胚率僅為59%左右，很少萌發成苗，因此其種子自然萌發率極低，繁殖困難。目前人工繁育多采用分株繁殖，即將塊莖切成小塊種植，但繁殖系數低、消耗量大、大面積供種依然較為困難，難以滿足大規模生產的需求。采取植物組織培養技術，可在短時間內獲得大量的白芨實生苗，是一種快速有效的繁殖方法，目前主要通過將種子撒播在添加激素的固體培養基上萌發，再生出無菌苗，或誘導原球莖、經增殖生根后進行快繁，這要涉及4～5種以上的培養基，操作較為繁瑣，且周期較長，最短在110 d內方能成苗移栽，相對生產成本較高。為此課題組探討了一種基于液體培養基的白芨種苗離體快繁技術，
該技術選用液體培養基，用液體懸浮培養萌發種子，而不是常用的固體培養基表面萌發，其能有效地提高白芨種子萌發率，縮短白芨成苗時間，快速獲得白芨幼苗，下面將該技術介紹如下。
1 未成熟白芨種子離體培養
1.1 種子表面滅菌及萌發
選取開花授粉15周后、未開裂的白芨蒴果（含種子），在成都農業科技職業學院園林園藝分院實驗室超凈工作臺上用75%乙醇進行表面消毒30 s，去離子水沖洗1～2次。用解剖刀及鑷子仔細剝開果實，將種子小心地抖落到無菌組織培養瓶中，加適量5%的次氯酸鈉溶液（滴加1～2滴吐溫-20）消毒20 min。用滅菌的50目細胞篩過濾種子；再用去離子水沖洗、過濾，反復4～6次，沖去表面殘留的消毒液。將細胞篩上過濾的種子以MS+1.0 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖、pH 5.8的種子萌發液體培養基沖洗到三角瓶內，于25 ℃、100 r/min黑暗培養15-20 d。通常培養5 d后，種子即可萌發，此時轉入16 h/8 h的光周期環境下光照培養，一般接種15 d后種子發育形成葉片。
1.2 種子生長成芽
將接種15 d、已萌發的白芨種子經50目細胞篩濾去液體，把種子原球莖接種于MS+0.2 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂、pH 5.8的固體誘導成芽培養基上，盡量分散幼苗，每皿約100粒，于25 ℃、16 h/8 h光周期培養。一般培養30 d后，當幼芽生長為幼苗，約2 cm左右、根長約0.5 cm左右時即可進行生根培養。
1.3 生根培養
將平皿中的白芨幼苗接種到1/2 MS+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+2 g/L活性炭+6 g/L瓊脂、pH 5.8的固體生根培養基上，每瓶接種25～30株，于25 ℃、16 h/8 h光周期環境里培養，促進幼苗和根的生長，提高壯苗生根率。生根培養30 d后，組培苗生長為健壯的成苗，形態見圖1。
1.4 煉苗移栽
當白芨幼苗的根生長到3～5 cm時（一般在白芨種子萌發后75-90 d）即可煉苗移栽，栽前先逐漸揭開瓶蓋適應3-5 d外界環境，期間注意保持瓶內濕度。移栽時用清水洗凈根部瓊脂，避免損傷根及原球莖；將健壯的白芨組培苗移栽到裝好育苗基質的穴盤中，選蔬菜或花卉育苗基質即可，栽后基質澆透水，于煉苗棚中培養。棚中前期注意弱光保濕，第一周應覆蓋遮陽網保持弱光，并覆蓋薄膜保濕；移栽15 d后白芨成苗即生長正常，移栽30 d左右即可定植，定植后常規田間管理，移栽情況見圖2。白芨移栽存活的關鍵是原球莖的大小及活力，一般有原球莖的幼苗均能移栽存活，存活率可達95%以上。
2 近成熟白芨種子離體培養
2.1 種子表面滅菌及萌發
將開花后20周以上、近成熟的白芨蒴果（未開裂，含種子）用紗布包好，自來水流水沖洗30 min，再在超凈工作臺上用75%乙醇進行表面消毒30 s，無菌水沖洗1～2次，用解剖刀及鑷子小心剝開果實，將種子小心撥入無菌組培瓶中，加適量5%次氯酸鈉溶液（滴加2～3滴吐溫-20）消毒20 min。用滅菌的細胞篩（50目）過濾種子；再用去離子水沖洗、過濾，反復4～6次，沖去表面殘留的消毒液。將細胞篩（50目）上過濾的種子，用MS+2.0 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖、pH 5.8的種子萌發液體培養基沖洗到三角瓶內。25 ℃、100 r/min、黑暗培養15 d。
2.2 種子生長成芽
已萌發的種子經細胞篩（50目）濾去液體，將種子原球莖接種于MS+0.1 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂、pH 5.8的誘導成芽固體培養基上，盡量分散種子，每皿100粒。25 ℃、16 h/8 h光周期環境里培養20-30 d。
2.3 生根培養
將生成的幼苗及增殖的幼苗接種到1/2 MS+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+0.5 g/L活性炭+6 g/L瓊脂、pH 5.8的生根培養基里，每瓶25～30株，25 ℃、16 h/8 h光周期環境里培養30-40 d。
2.4 煉苗移栽
當白芨幼苗的根生長到3～5 cm長時，即可煉苗移栽，栽前先揭開瓶蓋適應外界環境3-5 d。移栽時先用清水洗凈根部瓊脂，注意不要損傷根及原球莖結構；將健壯的白芨組培苗移栽到裝有育苗基質的穴盤中，栽后澆透水，于煉苗棚中繼續培養。管理上前期注意弱光保濕，第一周應加蓋遮陽網保持弱光，并覆蓋薄膜保濕；移栽15 d后白芨成苗即可生長正常，移栽30 d左右即可定植；定植后常規田間管理。
3 成熟白芨種子離體培養
3.1 種子表面滅菌及萌發
將成熟的白芨蒴果（未開裂，含種子）用紗布包好，自來水流水沖洗30 min；在超凈工作臺上用75%乙醇進行表面消毒30 s，無菌水沖洗1～2次，用解剖刀及鑷子小心剝開果實，將種子小心撥入無菌組培瓶中，加適量5%次氯酸鈉溶液（滴加2～3滴吐溫-20）消毒20 min。將細胞篩（50目）上過濾的種子用MS+0.5 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖、pH 5.8的種子萌發液體培養基沖洗到三角瓶內。25 ℃、100 r/min黑暗培養15 d，萌發率達99%。
3.2 種子生長成芽
已萌發的種子經細胞篩（50目）濾去液體，將種子原球莖接種于MS+0.5 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂、pH 5.8的誘導成芽固體培養基上，每皿100粒。25 ℃、16 h/8 h光周期環境里培養20-30 d。
3.3 生根培養
將長大的幼苗及增殖的幼苗接種到1/2 MS+1.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+1.0 g/L活性炭+6 g/L瓊脂、pH 5.8的生根培養基上，每瓶25～30株，25 ℃、16 h/8 h光周期環境里培養30-40 d。
3.4 煉苗移栽
當培養出的白芨幼苗根生長到3～5 cm長時，煉苗移栽，栽前先揭開瓶蓋適應自然條件3-5 d。移栽先時用自來水洗凈根部附著的瓊脂，小心不要損傷根及原球莖結構；將健壯的白芨組培苗移栽到裝有基質的育苗穴盤中，栽后澆透水，于煉苗棚中放置整齊，繼續煉苗培養。管理上前期注意弱光保濕，第一周應加蓋遮陽網保持弱光，并覆蓋薄膜保濕；移栽15 d后白芨成苗即可生長正常，移栽30 d左右即可定植；定植后常規田間管理。
4 小結
采用近成熟的白芨種子進行液體懸浮培養，能顯著提高種子萌發率，可達99%，并加快原球莖的生成速度（15 d左右）。且該技術操作簡便，成本低廉，每瓶液體培養基可萌發數萬粒種子，且種子萌發整齊，出苗一致，污染率低，結合簡化的固體培養基培養，大大縮短了白芨組織培養周期，最快能在75～90 d內獲得大量健壯的無菌苗用于移栽，實現了白芨組培苗的高效快速生產，并有效簡化了操作程序，降低了生產成本，便于規模化生產。
作者：熊丙全 廖相建 鄭雪蓮
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